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CRISPR-Gold修复了杜氏肌营养不良症小鼠的突变

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在加州大学伯克利分校的科学家设计了一种新的方式来提供细胞内的CRISPR-Cas9基因编辑技术,并在小鼠中证明,该技术可以修复导致杜氏肌营养不良症,严重的肌肉萎缩症。一项新的研究显示,将一种CRISPR-Gold作为新的传递系统称为Duchenne型肌营养不良症的小鼠,导致18倍的矫正率和2倍的强度和敏捷性试验的增加控制群体。

CRISPR-Gold由15纳米金纳米粒子组成,与硫醇修饰的寡核苷酸(DNA-Thiol)缀合,与单链供体DNA杂交,随后与Cas9复合,并被破坏内含子细胞。

自2012年起,研究合着者加州大学伯克利分校和细胞生物学和化学教授Jennifer Doudna以及马克斯·普朗克感染生物学研究所的同事Emmanuelle Charpentier将Cas9蛋白转化为一种廉价,精确和易于使用的基因编辑器,研究人员希望基于CRISPR-Cas9的治疗将有一天彻底改变遗传疾病的治疗。然而,开发遗传疾病治疗仍然是医学领域的一大挑战。这是因为大多数遗传疾病只有在致病基因突变恢复到正常序列的情况下才能治愈,而这对传统疗法是不可能的。

然而,CRISPR / Cas9可以通过切割突变的DNA并触发同源性导向的DNA修复来纠正基因突变。然而,在实现基于CRISPR-Cas9的疗法的潜力之前,需要开发将安全递送必需组分(Cas9,将Cas9指向特定基因的指导RNA和供体DNA)安全递送入细胞的策略。将CRISPR-Cas9递送入细胞的常用技术使用病毒,但是该技术具有许多并发症。 CRISPR-Gold不需要病毒。

在这项新研究中,伯克利生物工程实验室的研究人员Niren Murthy和Irina Conboy的实验室证明,由于金纳米颗粒是一个关键组分,它们的新方法称为CRISPR-Gold,可以提供Cas9-结合和切割DNA的蛋白质 - 与引导RNA和供体DNA一起进入活体细胞以固定基因突变。 Murthy说:“CRISPR-Gold是第一个可以提供所有修正基因突变所需的CRISPR组件的运载工具,而不需要使用病毒。

这项研究发表在10月2日的杂志自然生物医学工程

CRISPR-Gold通过称为同源性定向修复的过程来修复DNA突变。科学家一直在努力开发同源性指导的基于修复的疗法,因为它们需要在与Cas9蛋白质相同的位置和时间进行活性,所述Cas9蛋白质是识别突变和供体DNA以校正突变的RNA指南。为了克服这些挑战,伯克利科学家发明了一种将所有这些成分结合在一起的输送容器,然后当容器在多种类型的细胞内时释放它们,引发同源性定向修复。 CRISPR-Gold的金纳米粒子包被供体DNA,并且还结合Cas9。当注射到小鼠体内时,它们的细胞识别CRISPR-Gold中的标记,然后导入递送容器。然后,通过一系列的细胞机制,CRISPR-Gold被释放到细胞的细胞质中并分解,迅速释放Cas9和供体DNA。

向模拟杜兴肌营养不良的小鼠的肌肉组织中单次注射CRISPR-Gold,将导致该疾病的肌营养不良蛋白基因的5.4%恢复到野生型或正常序列。这个修正率大约比用Cas9和供体DNA自己处理的小鼠高18倍,而修正率只有0.3%。

重要的是,研究人员指出,CRISPR-Gold忠实地恢复了肌营养不良蛋白的正常序列,这是比以前发表的方法有了显着的改进,这种方法仅去除了基因的缺陷部分,使其更短,并且将一种疾病转化为另一种,疾病。

CRISPR黄金也能够减少组织纤维化 - 疾病的肌肉功能不正常的标志 - 并增强强度和敏捷性与杜氏肌营养不良症的老鼠。与注射对照的小鼠相比,CRISPR-Gold处理的小鼠在小鼠强度和敏捷性的常规测试中显示悬挂时间增加两倍。

“这些实验表明,通过简单开发纳米颗粒可以同时封装所有的CRISPR组件,开发可以安全纠正基因突变的非病毒性CRISPR治疗,通过同源性定向修复的过程,”Murthy说过。

研究发现CRISPR-Gold的Cas9蛋白递送方法比CRISPR的病毒递送更安全,CRISPR除了毒性之外还通过连续表达这种DNA切割酶来扩大Cas9的副作用。当研究小组测试了CRISPR-Gold在小鼠中的基因编辑能力时,他们发现CRISPR-Gold有效地校正了引起杜氏肌营养不良的DNA突变,并发了最小的侧支DNA损伤。

研究人员对CRISPR-Gold的脱靶DNA损伤进行量化,发现与未暴露于CRISPR(0.005-0.2%)的典型细胞的典型DNA测序错误相似的损伤水平。为了测试可能的免疫原性,在CRISPR-Gold注射后24小时和两周分析小鼠的血流细胞因子谱。在多次注射或体重减轻后,CRISPR-Gold不会引起血浆中炎性细胞因子的急性上调,这提示CRISPR-Gold可以安全地使用多次,并且对肌肉中的基因编辑具有高的治疗窗口组织。 Conboy说:“CRISPR-Gold,更广泛地说,CRISPR纳米颗粒为更安全,准确地控制基因编辑工具的交付开辟了一条新的道路。 “最终,这些技术可以发展成杜氏肌营养不良症和其他一些遗传疾病的新药。”

需要进行临床试验来了解CRISPR-Gold是否能有效治疗人类遗传性疾病。研究合着者Kunwoo Lee和Hyo Min Park已经组建了一家初创公司GenEdit(Murthy拥有GenEdit的所有权股份),其重点是将CRISPR-Gold技术转化为人类。 Murthy和Conboy实验室也在研究下一代可以将CRISPR从血流中提取到组织中的颗粒,并优先选择成人干细胞作为基因矫正的最佳靶点,因为干细胞和祖细胞能够基因编辑,自我更新和分化。

Murthy说:“遗传病导致死亡率和发病率的破坏性水平很高,需要采取新的治疗策略。 “CRISPR-Gold通过非病毒传递Cas9蛋白,引导RNA和供体DNA,能够纠正体内致病基因突变,因此有可能发展成治疗遗传疾病的治疗剂。”

该研究由美国国立卫生研究院资助凯基基金会,摩尔基金会,李嘉诚基金会,印花布,派克,罗杰和SENS,以及日本科学技术局的创新中心(COI)计划。

来源:加州大学伯克利分校

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